Category:Method/Sample/PL/Oxidized: Difference between revisions
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# Samples were homogenized with 1mL methanol and extracted for 1 h at on ice.
# Samples(100mg) were homogenized with 1mL methanol and extracted for 1 h at on ice.
# Homogenates were centrifuged (7000 rpm, 4 ◦C, 5min).  
# Homogenates were centrifuged (7000 rpm, 4 ◦C, 5min).  
# Supernatant was diluted with 10 volumes of water adjusted to pH 3.0 with 0.1N HCl.
# Supernatant was diluted with 10 volumes of water adjusted to pH 3.0 with 0.1N HCl.
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# Lipid extracts were dried under a gentle stream of nitrogen, dissolved in 1mL of methanol, and stored at −80 ◦C until use.
# Lipid extracts were dried under a gentle stream of nitrogen, dissolved in 1mL of methanol, and stored at −80 ◦C until use.
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# 組織をメタノール 1mL でホモジナイズ、氷上で1時間放置し脂質を抽出  
# 組織(100mg)をメタノール 1mL でホモジナイズ、氷上で1時間放置し脂質を抽出  
# 遠心分離 (7000 rpm, 4 ◦C, 5min)  
# 遠心分離 (7000 rpm, 4 ◦C, 5min)  
# 上清を 0.1N HClでpH 3.0に調整した10倍量の水で希釈
# 上清を 0.1N HClでpH 3.0に調整した10倍量の水で希釈

Revision as of 06:59, 26 October 2010

Oxidized phospholipids

  1. Samples(100mg) were homogenized with 1mL methanol and extracted for 1 h at on ice.
  2. Homogenates were centrifuged (7000 rpm, 4 ◦C, 5min).
  3. Supernatant was diluted with 10 volumes of water adjusted to pH 3.0 with 0.1N HCl.
  4. Samples were applied to preconditioned (20mL of methanol and 20mL of water) C18 Sep-Pak cartridges (500mg, Waters, Millford, MA, USA).
  5. Cartridge was washed with 20mL of water to exclude nonvolatile ions followed by 10mL of hexane to exclude cholesterols and neutral lipids.
  6. Samples were eluted with 10mL of methyl formate to obtain oxidized fatty acids and 10mL of methanol to obtain oxidized phospholipids, successively.
  7. Lipid extracts were dried under a gentle stream of nitrogen, dissolved in 1mL of methanol, and stored at −80 ◦C until use.

  1. 組織(100mg)をメタノール 1mL でホモジナイズ、氷上で1時間放置し脂質を抽出
  2. 遠心分離 (7000 rpm, 4 ◦C, 5min)
  3. 上清を 0.1N HClでpH 3.0に調整した10倍量の水で希釈
  4. メタノール20mL 次いで水20mL で洗浄したC18 Sep-Pak カートリッジ (500mg, Waters, Millford, MA, USA)にサンプルを注入
  5. 水20mLでカートリッジに残るイオンを洗浄、ヘキサン10mLでコレステロールと中性脂質を除く
  6. ギ酸メチル10mLで酸化脂肪酸を溶出、メタノール10mL で酸化リン脂質を溶出
  7. 脂質を窒素ガス下で乾固、メタノール1mLに溶解、 −80 ◦C で保管

OxidizedPL-MRM.png

　　　　　図１　酸化脂質解析のための分子特異的測定方法

生体内で微量にしか存在しない酸化脂質の測定には、この三連四重極型でのみ行うことができるMS/MS法の一種で、親イオンと特徴的なプロダクトイオンの組み合わせで分子特異的に検出するmultiple reaction monitoring (MRM)を用いる。図に示したように、三連四重極型はQ1、 Q2、 Q3と書いた3つの四重極を持ち、主にQ1で親イオンを測定し、Q2で目的とする親イオンを破壊し、生成したプロダクトイオンをQ3で測定する。例えば、エイコサペンタエン酸（EPA）のモノヒドロキシ体の一つである5-HEPEを測定するには、親イオン317（Q1）と特徴的なプロダクトイオン115（Q3）の組み合わせを用いることで特異的に測定することができる。
OxidizedMRMreverseLC.png

　　　　　図２　MRMの特異性と逆相LCによる酸化脂肪酸の分離

一番上のクロマトグラフィーはEPAのモノヒドロキシ体を測定したものである。この混合ピークの中から、水酸基の結合位置の違いにより特徴づけられたプロダクトイオンを用いてMRMを行うことで、位置異性体である5-HEPEや8-HEPE、12-HEPEなどを特異的に検出することができる。また18-HEPEと17.18-epoxy EPAは特徴的なプロダクトイオンが一緒であるが、このとき逆相LCを用いることで分離することができる。この他に、逆相LCで分離する利点としては、分子間のイオン化抑制（感度の低下）を回避し、より高感度に測定が可能となることが挙げられる。
OxidizedPC-MS2.png

　　　　　図３　酸化リン脂質のMS/MS解析と測定方法

赤枠で囲った16:0（パルミチン酸）と青枠で囲った18:2（リノール酸）の13番目の炭素に水酸基が付加した脂肪酸が、結合した酸化ホスファチジルコリン（PC）の構造と、それをMS/MS解析したスペクトル図を示す。酸化ホスファチジルコリン（PC）には2つの脂肪酸が結合しており、それぞれの脂肪酸に相当するプロダクトイオンm1、m2と、さらにm2から水酸基のある部分で解離した特徴的なプロダクトイオンm3が生じる。それぞれのプロダクトイオンと親イオンとの組み合わせでMRMを行うと、図左下のオレンジで囲ったようなピークが検出される。この3つのクライテリアで一致するものがあれば、この分子種を同定することができる。
OxidizedReverseLC.png

　　　　　図４　逆相LCによるリン脂質・酸化リン脂質の分離

分析にかける前に逆相カラムを使うことで、生体内で量的に多いリン脂質と量的に少ない酸化リン脂質が分離できる。これにより、ある程度のイオン化抑制を回避した高感度測定が可能となる。なお、酸化リン脂質の中でもアルデヒド体、カルビキシル体とヒドロキシ体はきれいに分離できる。

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