1. Samples were homogenized with 1mL methanol and extracted for 1 h at on ice.
2. Homogenates were centrifuged (7000 rpm, 4 ◦C, 5min).
3. Supernatant was diluted with 10 volumes of water adjusted to pH 3.0 with 0.1N HCl.
4. Samples were applied to preconditioned (20mL of methanol and 20mL of water) C18 Sep-Pak cartridges (500mg, Waters, Millford, MA, USA).
5. Cartridge was washed with 20mL of water to exclude nonvolatile ions followed by 10mL of hexane to exclude cholesterols and neutral lipids.
6. Samples were eluted with 10mL of methyl formate to obtain oxidized fatty acids and 10mL of methanol to obtain oxidized phospholipids, successively.
7. Lipid extracts were dried under a gentle stream of nitrogen, dissolved in 1mL of methanol, and stored at −80 ◦C until use.

1. 組織をメタノール 1mL でホモジナイズ、氷上で1時間放置し脂質を抽出
2. 遠心分離 (7000 rpm, 4 ◦C, 5min)
3. 上清を 0.1N HClでpH 3.0に調整した10倍量の水で希釈
4. メタノール20mL 次いで水20mL で洗浄したC18 Sep-Pak カートリッジ (500mg, Waters, Millford, MA, USA)にサンプルを注入
5. 水20mLでカートリッジに残るイオンを洗浄、ヘキサン10mLでコレステロールと中性脂質を除く
6. ギ酸メチル10mLで酸化脂肪酸を溶出、メタノール10mL で酸化リン脂質を溶出
7. 脂質を窒素ガス下で乾固、メタノール1mLに溶解、 −80 ◦C で保管

　　　　　図１　酸化脂質解析のための分子特異的測定方法

図の一番上のクロマトグラフィーはEPAのモノヒドロキシ体を測定したものである。この混合ピークの中から、水酸基の結合位置の違いにより特徴づけられたプロダクトイオンを用いてMRMを行うことで、位置異性体である5-HEPEや8-HEPE、12-HEPEなどを特異的に検出することができる。また18-HEPEと17.18-epoxy EPAは特徴的なプロダクトイオンが一緒であるが、このとき逆相LCを用いることで分離することができる。この他に、逆相LCで分離する利点としては、分子間のイオン化抑制（感度の低下）を回避し、より高感度に測定が可能となることが挙げられる。